นำการออกแบบ Flow Cytometer ไปใช้อย่างรวดเร็วโดยใช้โมดูลในการเก็บข้อมูลที่มีความแม่นยำสูง

Flow cytometry ถูกใช้อย่างกว้างขวางโดยแพทย์และนักวินิจฉัยเพื่อวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของเซลล์ โดยการทำงานทีละเซลล์ จะทำการประเมินระดับโปรตีน สุขภาพของเลือด ความละเอียด และขนาดของเซลล์ ท่ามกลางคุณลักษณะอื่น ๆ แม้ว่าจะเป็นระบบที่มีความไวสูง แต่ผู้ออกแบบไซโตมิเตอร์ก็ยังอยู่ภายใต้แรงกดดันอย่างต่อเนื่องเพื่อเร่งเวลาในการวิเคราะห์ ซึ่งต้องใช้แนวทางใหม่ในโฟลว์ไซโตเมทรีและอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ที่เกี่ยวข้อง

ไซโตมิเตอร์นำเซลล์แต่ละเซลล์ไปสู่แสงเลเซอร์เพื่อสร้างสัญญาณกระจัดกระจายและเรืองแสง ในการจับภาพแสงที่ได้และแปลงเป็นสัญญาณดิจิตอลได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำนั้น จำเป็นต้องใช้โฟโตไดโอดหิมะถล่ม (APD) และอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ที่ซับซ้อน วงจรสำหรับกระบวนการนี้อาจใช้เวลานานในการออกแบบและใช้งาน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เนื่องจากระบบเก็บข้อมูลโฟลไซโตเมทรีนั้นต้องการอุปกรณ์ความเร็วสูงและสัญญาณรบกวนต่ำเพื่อรับรองความถูกต้องของระบบ

เพื่อสนับสนุนการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีที่เร็วขึ้นอย่างคุ้มค่า นักออกแบบสามารถแก้ไขปัญหาความเร็วและความแม่นยำด้วยโซลูชันการเก็บข้อมูลที่ประกอบด้วยไดรเวอร์แอมพลิฟายเออร์ภายในและตัวแปลงแอนะล็อกเป็นดิจิทัล (ADC)

บทความนี้จะแสดงให้เห็นโดยย่อว่าระบบโฟลว์ไซโตเมทรีทำงานอย่างไร แล้วมาแนะนำอุปกรณ์ Analog Devices ADAQ23878 ซึ่งเป็นโมดูล ADC แบบ 18 บิต และแสดงให้เห็นว่าสามารถใช้เพื่อออกแบบการตรวจจับโฟลว์ไซโตมิเตอร์และขั้นตอนการแปลงได้อย่างไร จะมีการแนะนำชุดการประเมินที่เกี่ยวข้องด้วย

หลักการโฟลว์ไซโตเมทรีที่ทันสมัย

โฟลว์ไซโตเมทรีสมัยใหม่เป็นกระบวนการอัตโนมัติที่วิเคราะห์โมเลกุลของเซลล์และพื้นผิว กำหนดลักษณะเฉพาะ และกำหนดประเภทเซลล์ที่แตกต่างกันในจำนวนเซลล์ที่ต่างกัน โดยไม่นับเวลาเตรียมการ ซึ่งอาจมากกว่าหนึ่งชั่วโมง เครื่องมือจะทำการประเมินลักษณะเฉพาะสามถึงหกเซลล์ 10,000 เซลล์เดียวในเวลาน้อยกว่าหนึ่งนาที

เพื่อดำเนินงานนี้ ขั้นตอนการเตรียมเซลล์เดียวของโฟลว์ไซโตเมทรีจึงเป็นสิ่งที่มีความสำคัญ การจัดระเบียบของตัวอย่างเกิดขึ้นในปลอกของไหลพลังน้ำเพื่อโฟกัสเซลล์หรืออนุภาคลงในสตรีมตัวอย่างที่มีเส้นเซลล์เดียวที่แคบสำหรับการวิเคราะห์ ด้วยการเปลี่ยนแปลงนี้ เซลล์เดี่ยวจะต้องคงไว้ซึ่งลักษณะทางชีววิทยาตามธรรมชาติและองค์ประกอบทางชีวเคมี

รูปที่ 1 แสดงไดอะแกรมของเครื่องมือโฟลว์ไซโตมิเตอร์ที่เริ่มต้นที่ด้านบนสุดด้วยตัวอย่างหลายเซลล์

รูปที่ 1: แผนผังของโฟลว์ไซโตมิเตอร์ ตั้งแต่การโฟกัสแบบปลอกไปจนถึงการเก็บข้อมูล (ที่มาของภาพ: Wikipedia แก้ไขโดย Bonnie Baker)

องค์ประกอบหลักหกประการของโฟลว์ไซโตมิเตอร์ ได้แก่ โฟลว์เซลล์ เลเซอร์ โฟโตไดโอดหิมะถล่ม (APD) แอมพลิฟายเออร์ทรานส์อิมพีแดนซ์ (TIA) ADC และคอมพิวเตอร์สำหรับการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล

โฟลว์ไซโตมิเตอร์มีกระแสของเหลวหรือของเหลวของปลอก ซึ่งถูกจำกัดให้แคบลงเพื่อลำเลียงและจัดตำแหน่งเซลล์ให้เป็นไฟล์เดียวผ่านลำแสง แสงเลเซอร์จับเซลล์ทีละเซลล์ สร้างสัญญาณแสงที่กระจัดกระจายไปข้างหน้า (FSC) และสัญญาณแสงที่กระจัดกระจายด้านข้าง (SSC) แสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์จะจัดเรียงโดยใช้กระจกและฟิลเตอร์ จากนั้นจึงขยายด้วย APD

ขั้นตอนต่อไปคือการตรวจจับ แปลงเป็นดิจิทัล และวิเคราะห์เอาต์พุตแสงที่ได้หลังจากที่กระทบกับ APD สำหรับการตรวจจับ อุปกรณ์จาก Analog Devices รุ่น LTC6268 500 เมกะเฮิรตซ์ (MHz) กระแสไบแอสที่ค่าต่ำมาก, สัญญาณรบกวนแรงดันต่ำ FET อินพุต op amp เหมาะสำหรับ TIA ความเร็วสูงที่จำเป็นสำหรับการตรวจจับ

รูปที่ 2: วงจร TIA ใช้ APD (PD₁) และ FET op amp กระแสไฟอินพุตต่ำเพื่อแปลงกระแสโฟโตไดโอดต่ำพิเศษเป็นแรงดันเอาต์พุตที่ IN1+ (ที่มาของภาพ: Bonnie Baker)

จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องออกแบบวงจรแอมพลิฟายเออร์นี้ด้วยแบนด์วิดท์ที่กว้างที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ดังนั้นจึงต้องลดค่าความจุแฝง ตัวอย่างเช่นความจุป้อนกลับของ C แฝงมีอิทธิพลต่อความเสถียรของวงจรและแบนด์วิดท์ของรูปที่ 2 โดยไม่คำนึงถึงตัวเลือกแพ็คเกจตัวต้านทาน จะมีความจุแฝงในเส้นทางป้อนกลับของแอมพลิฟายเออร์เสมอ อย่างไรก็ตาม แพ็คเกจ 0805 ซึ่งมีระยะห่างระหว่างตัวปิดปลายและความจุแฝต่ำสุดที่ไกลกว่านั้น เหมาะสมกว่าสำหรับการใช้งานความเร็วสูง

การเพิ่มระยะห่างระหว่างปลายตัวประจุไฟฟ้าของ R₁ ไม่ใช่วิธีเดียวที่จะลดความจุ อีกวิธีหนึ่งในการลดความจุของจานต่อจานคือการป้องกันเส้นทางสนาม E ที่ก่อให้เกิดความจุกาฝากโดยการวางรอยกราวด์พิเศษไว้ใต้ความต้านทาน R₁ (รูปที่ 3).

รูปที่ 3: การเพิ่มการติดตามกราวด์ภายใต้ตัวต้านทานป้อนกลับจะแบ่งฟิลด์ E ออกจากด้านป้อนกลับและทิ้งลงกับพื้น (แหล่งที่มารูปภาพ: Analog Devices)

ในตัวอย่างนี้ วิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการวางรอยกราวด์สั้น ๆ ด้านล่างและระหว่างแผ่นต้านทานใกล้กับปลายเอาต์พุตของ TIA เทคนิคนี้แสดงค่าความจุแฝง 0.028 picofarads (pF) ด้วยแบนด์วิดท์ TIA ที่ 1/(2π*R_F*C_PARASITIC)เท่ากับ 11.4 MHz.

สัญญาณแสงออปติคัลชี้ไปที่ไดโอด avalanche หลายตัวพร้อมตัวกรองแสงที่เหมาะสม ระบบ APD, TIA และ ADC จะแปลงสัญญาณเหล่านี้เป็นการแสดงข้อมูลดิจิทัลและส่งข้อมูลไปยังไมโครโปรเซสเซอร์เพื่อทำการวิเคราะห์ต่อไป

เครื่องมือสมัยใหม่มักจะมีเลเซอร์และ APD หลายตัว อุปกรณ์เชิงพาณิชย์ในปัจจุบันประกอบด้วยเลเซอร์สิบตัวและโฟโตไดโอ avalanche 30 ตัว การเพิ่มจำนวนเครื่องตรวจจับด้วยเลเซอร์และโฟโตมัลติเพลเยอร์ช่วยให้สามารถติดฉลากแอนติบอดีหลายตัวเพื่อระบุประชากรเป้าหมายได้อย่างแม่นยำด้วยเครื่องหมายฟีโนไทป์

ถึงกระนั้น ความเร็วในการวิเคราะห์ก็ขึ้นอยู่กับความสมดุลที่ดีของ:

• ความเร็วของปลอกของเหลว
• ความสามารถของกระบวนการโฟกัสแบบพลังน้ำเพื่อสร้างเส้นเซลล์เดียว
• เส้นผ่าศูนย์กลางท่อ
• ความสามารถในการรักษาความสมบูรณ์ของเซลล์
• เครื่องใช้ไฟฟ้า

Flow cytometry แบบอะคูสติกโฟกัส

ในขณะที่การเพิ่มเลเซอร์และ APD หลายตัวช่วยเร่งการวิเคราะห์และการระบุ อย่างดีที่สุด วิธีเซลล์เดียวที่ทันสมัยล่าสุดสามารถรวบรวมข้อมูลได้มากถึงหนึ่งล้านเซลล์ต่อนาที ในการใช้งานหลายอย่าง เช่น การตรวจหาเซลล์เนื้องอกที่ไหลเวียนอยู่ในเลือดในระดับต่ำถึง 100 เซลล์ต่อมิลลิลิตร ถือว่าไม่เพียงพอ ในการใช้งานทางคลินิกที่มีเซลล์หายาก การทดสอบเป็นประจำต้องการการวิเคราะห์เซลล์หลายพันล้านเซลล์ที่ใช้เวลานาน

ทางเลือกแทนกระบวนการเตรียมเซลล์ที่เน้นด้วยอุทกพลศาสตร์คือกระบวนการแบบอะคูสติกโฟกัส ที่นี่ วัสดุเพียโซอิเล็กทริก เช่น ตะกั่วเซอร์โคเนตไททาเนต (PZT) ติดอยู่กับเส้นเลือดฝอยแก้วเพื่อแปลงพัลส์ไฟฟ้าเป็นการสั่นสะเทือนทางกล (รูปที่ 4a) ด้วยการใช้ PZT ในการสั่นที่ผนังด้านข้างของเส้นเลือดฝอยแก้วที่ความถี่เรโซแนนซ์ของโฟลว์เซลล์รูปสี่เหลี่ยมผืนผ้า ระบบจะสร้างคลื่นเสียงนิ่งที่หลากหลายด้วยจำนวนโหนดแรงดันที่แตกต่างกัน

รูปที่ 4: ภาพประกอบของอะคูสติกโฟลว์เซลล์ที่สร้างด้วยเส้นเลือดฝอยแก้วสี่เหลี่ยม (a) ตำแหน่งของโหนดแรงดันสามโหนดแรกสำหรับเส้นเลือดฝอยที่มีความกว้างคงที่ (b) (ที่มาของภาพ: ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ)

โหนดความถี่ PZT เหล่านี้จัดแนวอนุภาคที่ไหลในสตรีมไลน์ที่ไม่ต่อเนื่องหลายรายการ (รูปที่ 4b) เซลล์อะคูสติกโฟลว์ใช้คลื่นอะคูสติกแบบยืนเป็นเส้นตรงเพื่อปรับเป็นความยาวคลื่นต่าง ๆ โดยสร้างฮาร์มอนิกเดี่ยวหรือหลายฮาร์มอนิก ตามที่คาดการณ์โดยแบบจำลองคลื่นนิ่งเชิงเส้นอย่างง่าย เซลล์ในตัวอย่างจะสร้างสายเซลล์เดียวหรือหลายเซลล์ภายในช่องการไหล

ด้วยการจัดเรียงเซลล์ที่แม่นยำนี้ ความกว้างของปลอกการไหลสามารถกว้างขึ้นเพื่อให้อัตราการไหลผ่านลำแสงเลเซอร์เร็วขึ้น (รูปที่ 5)

รูปที่ 5: ด้วยกระแสพลังน้ำตัวอย่าง (c. และ d.) เมื่อความกว้างของปลอกเพิ่มขึ้น ตัวอย่างเซลล์จะกระจัดกระจาย ทำให้กระบวนการวัดด้วยแสงทำได้ยาก สตรีมตัวอย่างแบบอะคูสติกโฟกัส (a. และ b.) รักษาเซลล์แบบไฟล์เดียวโดยไม่คำนึงถึงความกว้างของปลอก (ที่มาของภาพ: Thermo Fischer Scientific)

การโฟกัสแบบอุทกพลศาสตร์แบบดั้งเดิม (รูปที่ 5c.) จัดเรียงเส้นเซลล์เดียวเพื่อเตรียมพร้อมสำหรับการสแกนด้วยเลเซอร์ ในขณะที่กรวยที่กว้างกว่าสำหรับแกนสตรีมตัวอย่างยอมให้มีความเร็วของวัสดุปลอกที่สูงกว่า (รูปที่ 5d.) แต่ยังส่งผลให้เกิดการแพร่กระจายของการจัดระเบียบเซลล์เดียว ทำให้เกิดความผันแปรของสัญญาณและคุณภาพของข้อมูลที่ถูกลดทอนลง

การปรับโฟกัสแบบอะคูสติก (รูปที่ 5a.) จะจัดตำแหน่งเซลล์ชีวภาพและอนุภาคอื่น ๆ ให้อยู่ในแนวเดียวกัน แม้ในอุโมงค์ที่กว้างกว่า การจัดตำแหน่งเซลล์ที่แม่นยำช่วยให้อัตราการสุ่มตัวอย่างสูงขึ้นในขณะที่ยังคงคุณภาพข้อมูลไว้ (รูปที่ 5b.)

ในทางปฏิบัติ การโฟกัสอะคูสติกของโฟลว์ไซโตเมทรีจะเพิ่มความถี่ในการสุ่มตัวอย่างเซลล์ ~20x (รูปที่ 6)

รูปที่ 6: การเปรียบเทียบเวลาสุ่มตัวอย่างสำหรับอุปกรณ์โฟลว์ไซโตเมทรีแบบต่าง ๆ ที่อิงตามโฟลว์ไซโตเมทรีของของไหล (A, B, C) กับโฟลว์ไซโตเมทรี (D) (ที่มาของภาพ: Thermo Fischer Scientific)

ในรูปที่ 6 อุปกรณ์จาก A, B และ C ใช้เทคโนโลยีอุทกพลศาสตร์ ในขณะที่ D ใช้วิธีโฟลว์โฟลว์ไซโตเมทรีแบบอะคูสติกโฟกัส

การเก็บข้อมูลโฟลว์ไซโตเมทรีแบบอะคูสติกโฟกัส

การออกแบบอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์สำหรับอุปกรณ์โฟลว์ไซโตเมทรีแบบอะคูสติกโฟกัส ต้องใช้อุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ตรวจจับภาพถ่ายความเร็วสูงเพื่อรองรับความเร็วของเซลล์เม็ดเลือดและปลอกของเหลวหุ้มผ่านหัวฉีดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางขนาดใหญ่กว่า LTC6268 ความเร็วสูง 600 MHz ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ ร่วมกับโครงร่างแพ็คเกจตัวต้านทาน 0805 เฉพาะ ทำให้อัตราการตรวจจับด้วยแสงสูงถึง 11.4 MHz (รูปที่ 7 ซ้าย) เอาต์พุตของ LTC6268 ถูกป้อนไปยัง Analog Devices ADAQ23878 ADC สำหรับการแปลงเป็นดิจิทัล

รูปที่ 7: ADAQ23878 ADC แปลงสัญญาณออปติคัลจากโฟโตไดโอด (PD₁) เป็นสัญญาณดิจิทัลและวงจร TIA (ซ้าย) (ที่มาของภาพ: Bonnie Baker)

ADAQ23878 เป็นแบบ 18 บิต 15 เมกะตัวอย่างต่อวินาที (MSPS) โซลูชันการรับข้อมูลระบบในแพ็คเกจ (SIP) ที่มีความแม่นยำและความเร็วสูง ช่วยลดรอบการพัฒนาของระบบการวัดความแม่นยำได้อย่างมีนัยสำคัญ โดยการถ่ายโอนภาระการออกแบบของการเลือกส่วนประกอบไดรเวอร์อินพุต การปรับให้เหมาะสม และเลย์เอาต์จากผู้ออกแบบไปยังอุปกรณ์

วิธีการแบบโมดูลาร์ของ SIP ช่วยลดจำนวนส่วนประกอบของระบบปลายทางโดยการรวมการประมวลผลสัญญาณทั่วไปหลายบล็อกและบล็อกการปรับสภาพในอุปกรณ์เครื่องเดียว ร่วมกับ ADC ความเร็วสูง 18 บิต 15 MSPS ต่อเนื่องโดยประมาณ (SAR) บล็อกเหล่านี้รวมถึงแอมพลิฟายเออร์ไดรเวอร์ ADC ที่มีสัญญาณรบกวนต่ำแบบ fully-differential และบัฟเฟอร์อ้างอิงที่เสถียร

ADAQ23878 ยังรวมเอาส่วนประกอบแบบพาสซีฟที่สำคัญซึ่งใช้เทคโนโลยี iPassive ของ Analog Devices เพื่อลดแหล่งข้อผิดพลาดที่ขึ้นกับอุณหภูมิและเพิ่มประสิทธิภาพการทำงาน ขั้นตอนการติดตั้งที่รวดเร็วของไดรเวอร์ของ ADC มีส่วนช่วยเพิ่มความสามารถในการรับรองการได้มาของข้อมูลได้อย่างรวดเร็ว

การประเมิน ADAQ23878 µModule

ในการประเมินอุปกรณ์รุ่น ADAQ23878 Analog Devices ได้นำเสนอบอร์ดประเมินผล EVAL-ADAQ23878FMCZ (ภาพที่8) บอร์ดนี้แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของ ADAQ23878 μModule และเป็นเครื่องมืออเนกประสงค์สำหรับการประเมินการออกแบบ front-end ของโฟลว์ไซโตเมทรี และการใช้งานอื่น ๆ ที่หลากหลาย

รูปที่ 8: บอร์ดประเมินผล EVAL-ADAQ23878FMCZ สำหรับ ADAQ23878 มีวงจรไฟฟ้าในตัว มาพร้อมกับซอฟต์แวร์ที่เกี่ยวข้องสำหรับการควบคุมและการวิเคราะห์ข้อมูล และเข้ากันได้กับ SDP-H1 (แหล่งที่มารูปภาพ: Analog Devices)

บอร์ดประเมินผล EVAL-ADAQ23878FMCZ ต้องใช้คอมพิวเตอร์ส่วนบุคคลที่ใช้ Windows 10 หรือสูงกว่า ซึ่งมีสัญญาณรบกวนต่ำ แหล่งสัญญาณที่แม่นยำ และตัวกรองแบนด์พาสที่เหมาะสำหรับการทดสอบ 18 บิต คณะกรรมการประเมินผลต้องการ ADAQ23878ACE ปลั๊กอินและไดรเวอร์ SPD-H1

บทสรุป

การตรวจสอบเซลล์ทางชีววิทยาครั้งละหนึ่งเซลล์โดยใช้เทคนิค hydrodynamic focus flow cytometry มาตรฐานประสบความสำเร็จในการตรวจสอบ แต่ด้วยความจำเป็นที่ต้องปรับให้การวิเคราะห์รวดเร็วขึ้น จึงได้มีการเปลี่ยนไปใช้เทคนิคต่าง ๆ โดยอาศัยวิธีการโฟลว์โฟกัสแบบอะคูสติก อย่างไรก็ตาม อุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ที่รองรับโฟลว์ไซโตเมตรียังต้องปรับปรุง ในขณะที่ลดพื้นที่ ต้นทุน และเวลาในการพัฒนาให้เหลือน้อยที่สุด

ตามที่แสดง op amp ความเร็วสูง LTC6268 และโซลูชันการรับข้อมูล μModule ที่มีความแม่นยำสูง ADAQ233878 ความเร็วสูง สามารถนำมารวมกันเพื่อสร้างระบบเก็บข้อมูลที่สมบูรณ์สำหรับอุปกรณ์โฟลว์ไซโตเมทรีขั้นสูง